ATAC-Me：一份样本，同时检测染色质可及性和DNA甲基化

染色质可及性和DNA甲基化是细胞分化和发育中两个重要的表观遗传特征。获取一份样本里这两种表观特征及阐述两者之间关系的常见手段，是将同一份样本一分为二，分别构建ATAC文库和DNA甲基化文库后进行测序分析，后续基于生物信息学进行关联分析。

ATAC-Me，一种新的技术手段，可以在单个文库中直接鉴定可及染色质和DNA甲基化的时间动态。因此，针对不同发育和/或分化阶段可及染色质与DNA甲基化之间的相关性研究这个技术更为方便和经济[1]。此外，使用设计的生物信息学工具，可以更容易地预测转录因子结合、顺式调节元件(CREs)、DNA甲基化和染色质可及性之间的相互作用，以进一步表征特定发育和分化阶段的表观遗传学特征。

首先，提取细胞核，与装配有甲基化接头的Tn5转座酶一起孵育。甲基化的接头标记了可接近的区域。

其次，将获得的DNA片段富集并用亚硫酸氢钠处理，未甲基化的胞嘧啶被转化为胸腺嘧啶。由于甲基化的接头不会被亚硫酸氢钠转化，在文库构建过程中，这些DNA片段很容易被特异性测序引物扩增。

最后，在测序后通过生物信息学工具同时识别可及区域和DNA甲基化。

一个典型的ATAC-Me实验可以检测到约60,000-75,000个peak区域(P < 0.05)，覆盖约300-400万个CpG位点，覆盖率至少为5倍[2]。

◆ 优 势：

▶ ATAC-Me是一个方便的策略，允许同时研究DNA甲基化和染色质可及性的时间动力学。

▶ ATAC-Me数据可以鉴定甲基化和非甲基化转录因子(TF)结合基序。

▶ ATAC-Me允许用低输入量材料检测开放染色质区域中可及的染色质动力学和DNA甲基化状态。

▶ ATAC-Me数据可以整合其他高通量测序数据(例如RNA-seq、Hi-C和ChIP-seq)，有助于进一步表征特定样品中的全基因组表观遗传特征。

◆ 挑 战：

▶ 一些富含次生代谢产物(如多糖和多酚)的植物组织会影响高质量的细胞核提取和随后的ATAC-Me文库构建。

▶ ATAC-Me检测到的DNA甲基化信息仅限于基因组的可及区域。

▶ 将ATAC-Me数据中的短reads映射到复杂的植物基因组(例如，包含大量重复元件)是非常低效的。当前为植物基因组设计的生物信息学分析方法需要改进以处理ATAC-Me数据。

2020年3月19日，Molecular Cell上在线发表了一篇题为“ATAC-Me Captures Prolonged DNA Methylation of Dynamic Chromatin Accessibility Loci during Cell Fate Transitions”的论文。研究开发了ATAC-Me，利用单个DNA文库制备同时探索染色质可及性和DNA甲基化，在单核细胞-巨噬细胞命运模型中发现了数千个骨髓增强子的可及性波。这些位点上大多数存在着延长的甲基化状态，而邻近基因的转录与可及性密切相关。ATAC-Me揭示了染色质可及性、DNA甲基化状态和基因活性之间的显著脱节，突显了ATAC-Me在构建精确的分子时间线以理解DNA甲基化在基因调控中的作用的价值。

众所周知，亚硫酸氢盐处理会破坏DNA完整性。ATAC-Me的数据与标准ATAC-seq数据的比较显示，虽然二核小体和三核小体的片段损失较大，但单核小体的片段得以保留(图1A、1B)。ATAC-Me在所有时间点平均检测到57,217个高置信度、可重复的peaks，这个数量虽然是同一样本在标准ATAC-seq里检测到的peaks的两倍之多，但标准ATAC-seq中超过75%的peak区域在配对的ATAC-Me数据集重现(图1C)，同时两个数据集间的peak信号高度一致(r≈0.85，图1D、E)，这都说明ATAC-Me是可重复并能重现标准ATAC-seq结果。

图1 ATAC-Me和标准ATAC-seq的比较

除了获得染色质可及性信息，ATAC-Me还能获取可及染色质区域内的DNA甲基化状态。同时，作者还用T-WGBS获取了配对样品的标准甲基化组。与WGBS中典型的甲基化水平双峰分布相比，ATAC-Me和WGBS的甲基化水平在peak区域内基本一致(r≈0.90)，并广泛低甲基化(图2A)。等位基因调控区(ARRs)由一个低甲基化的染色质可及等位基因和一个高甲基化的不可及等位基因组成，根据WGBS其甲基化程度应为50%，而ATAC-Me方法应该选择性地富集这些ARRs中染色质可及的低甲基化等位基因。事实上，ATAC-Me分析的ARRs甲基化水平确实明显低于WGBS分析(图2B)。这代表了，1）ATAC-Me对可及的DNA片段具有高度选择性，与WGBS相比，可以更深入地了解染色质背景下的甲基化状态；2）观察到的可及片段的甲基化不是由随机噪音引起的。

图2 ATAC-Me和传统WGBS在非等位基因调控区等位基因调控区间的比较

总的来说，稳定状态下的ChrAcc区域的ATAC-Me CpG甲基化水平与WGBS高度一致。同时，ATAC-Me又独特地允许确定可及染色质区域的甲基化，已知在这些区域TFs和其他蛋白质与DNA相互作用，因此与传统的WGBS相比，为DNAme模式提供了增强的生物学背景。此外，与传统的WGBS相比，ATAC-Me序列覆盖高度集中在可及DNA片段，在探索靶标DNAme上只需要更少的数据量，类似于ERRBS。使用一个标准ATAC-seq数据测度，即可同时有效的获取染色质可及性和DNA甲基化。ATAC-Me文库中的序列复杂性(或不同reads数量)虽低于标准ATAC-seq，但明显高于对应测序深度的ERRBS文库的复杂性(图3)。

图3 各种测序方法的DNA文库复杂性分析

1、Zhu, Wenjun, et al. "ATAC-Me simultaneously decodes chromatin accessibility and DNA methylation." Trends in Plant Science (2023).

2、Guerin, Lindsey N., Kelly R. Barnett, and Emily Hodges. "Dual detection of chromatin accessibility and DNA methylation using ATAC-Me." Nature Protocols 16.12 (2021): 5377-5397.

3、Barnett, Kelly R., et al. "ATAC-Me captures prolonged DNA methylation of dynamic chromatin accessibility loci during cell fate transitions." Molecular cell 77.6 (2020): 1350-1364.

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