N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最丰富的内部化学修饰，在基因表达调控中发挥重要作用，包括转录和转录后调控。m6A是一种可逆修饰，分别被甲基转移酶（writers）、去甲基酶（erasers）和m6A结合蛋白（readers）写入、移除和识别。近年来，m6A在植物中的研究拓宽，研究了m6A在作物发育、生物和非生物胁迫反应以及作物性状改良中的重要作用。
2023年5月8日，北京大学化学与分子工程学院贾桂芳团队在Plant Communications上发表了有关m6A的综述《Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants》。系统讨论了m6A的最新研究进展，并重点介绍了m6A在植物中的检测方法、分布、调节蛋白以及分子和生物学功能。作者还对未来的研究进行了一些展望，为后续植物中m6A的研究提供了方向。
m6A检测技术的发展是研究m6A功能的基础。薄层色谱法（TLC）、斑点印迹法（dot-blots）和液相色谱-质谱串联法（LC–MS/MS）是广泛用于测量RNA m6A水平全球变化的方法。然而，这些方法无法分析m6A在转录组水平的分布，也无法识别特定基因中的m6A位点。在这篇文章中，作者介绍了一些已经应用于研究植物m6A以及那些在植物中具有应用潜力的技术。
有关DNA化学修饰的测序方法很多，但开发RNA的m6A测序方法仍有许多困难。首先，RNA不能直接用于扩增，必须首先逆转录成cDNA。然而，m6A的结构不影响正常的碱基配对，并且m6A位点信息在逆转录过程中容易丢失。第二，尽管m6A是真核生物mRNA最丰富的修饰，但其绝对含量非常低，细胞中仍存在大量的rRNA和tRNA干扰。因此，有必要通过高度特异性的方法在复杂系统中富集含有m6A的RNA。最近，m6A的各种高通量测序技术已经问世，促进了这种RNA修饰的功能研究。
1.1.1.1、MeRIP-seq/m6A-seq
MeRIP-seq/m6A-seq是第一种使用m6A抗体开发的高通量测序技术（Dominissini等人，2012；Meyer等人，2012）。在这项技术中，mRNA被片段化为100–200nt，然后与m6A抗体一起孵育，洗脱的RNA用于文库构建和测序。甲基化区域被检测为免疫沉淀RNA相对于输入RNA的转录物覆盖率的峰值（图1）。MeRIP-seq/m6A-seq以大约200nt的分辨率提供m6A信息。MeRIP-seq/m6A-seq操作简单，并且所有试剂都已商业化，一直是m6A测序的首选。
图1 MeRIP-seq/m6A-seq技术原理
1.1.1.2、m6A-seq2
m6A-seq2是MeRIP-seq/m6A-seq的升级技术（Dierks等人，2021）。在m6A-seq2中，单个m6A免疫共沉淀（m6A-IP）对合并的RNA样本而不是一次一个样本执行。条形码RNA接头被连接到不同样品来源的片段化RNA上，并在合并的样品上进行单个的抗m6A-IP，然后根据条形码序列分配每个原始样本的reads（图2）。所有m6A-IP都在单管中进行，这样可以减少技术变异性、材料起始量和文库制备的成本。此外，考虑到不同样本之间对固定量抗体的竞争，该方法可能能够比较不同样本间全局m6A水平。
图2 m6A-seq2技术原理
1.1.1.3、m6A-CLIP/miCLIP
m6A-seq和m6A-seq2都不能做到m6A的单碱基分辨，由此开发的m6A-CLIP/miCLIP是m6A单碱基分辨的解决方案（Ke等人，2015；Linder等人，2015）。在这种方法中，将片段化的RNA与m6A抗体一起孵育，然后用254 nm紫外光交联RNA-抗体复合物。通过蛋白酶消化获得的氨基酸残基阻碍了逆转录中的碱基配对，导致m6A位点附近的切割或突变，m6A位点信息最终以单碱基分辨率获得（图3）。抗体和RNA的结合效率和交联效率将是影响最终测序结果的主要因素。此外，交联主要发生在抗体的芳香族氨基酸和RNA的嘧啶碱基之间。因此，这两种方法不直接鉴定单个m6A位点，而是从相邻嘧啶位点的突变来推断它们。由于这个原因，这两种方法不能准确地定位多个相邻腺嘌呤中的m6A，并且分析群集的m6A分布是困难的。
图3 m6A-CLIP/miCLIP技术原理
基于抗体的m6A高通量测序技术有明显的缺点：1）、m6A抗体的质量不容易控制，而且使用不同制造商的抗体获得的结果也截然不同。2）、抗体的高昂价格和测序所需的大量RNA也阻碍了其大规模应用。为了克服这些缺点，最近提出了各种不依赖抗体的m6A高通量测序方法。
1.1.2.1、m6A-SEAL-seq
m6A-SEAL-seq是一种FTO辅助的m6A选择性化学标记方法，利用去甲基酶FTO的特性在体外标记m6A（Wang等，2020）。FTO用于将m6A氧化为中间产物hm6A，hm6A用二硫苏糖醇（DTT）进一步转化为稳定的N6-二硫甲酰甲基腺苷（dm6A）。然后用生物素标记dm6A，从而能够富集含有原始m6A的RNA片段。对富集的RNA进行测序以获得m6A位点信息（图4）。该方法的优点是所需的初始RNA量较低，并且FTO具有较强的去甲基化活性，几乎没有序列选择性；缺点是它涉及许多操作，需要很长时间，并且分辨率与MeRIP-seq类似。
图4 m6A-SEAL-seq技术原理
1.1.2.2、m6A-SAC-seq
选择性烯丙基化学标记和测序（m6A-SAC-seq）可以直接标记m6A，覆盖几乎所有的m6A经典基序，并以单碱基分辨率定量分析捕获的m6A位点（Hu等，2022）。这种方法利用特定的酶在m6A上加一个烯丙基化学基团，形成a6m6A，经I2处理后发生环化，并在随后的逆转录过程中被逆转录酶读为突变。基于突变位点检测转录组中m6A的位置，并通过使用标准曲线转换突变率获得m6A含量的准确信息(图5)。m6A-SAC-seq可以广泛应用于各种生物学背景，在基础生物学研究和临床应用方面具有良好的前景。m6A-SAC-seq的主要限制是该反应基于酶，因此可能具有序列偏好。
图5 m6A-SAC-seq技术原理
1.1.2.3、Nanopore m6A-seq
纳米孔直接RNA测序（DRS）是另一种可以在单碱基分辨率下鉴定m6A修饰的测序技术(Dierks等人，2021；高等，2021；Leger等人，2021年)。当RNA通过纳米孔时，RNA序列被纳米孔表面的电场强度识别。RNA修饰引起强度水平的变化，因此可以通过单碱基分辨率的计算来确定修饰的碱基(图6)。虽然纳米孔直接RNA-seq可以在单碱基水平上识别m6A修饰，但仍然存在一些缺点，如成本高、准确性低、对RNA质量和初始量的要求较高。
图6 Nanopore m6A-seq技术原理
1.1.2.4、GLORI-seq
乙二醛和亚硝酸盐介导的非甲基化腺苷脱氨基和测序（GLORI-seq）是最新报道的技术；它能够对单碱基m6A位点进行有效和无偏倚的检测，并对m6A修饰水平进行绝对定量（Liu等人，2022）。GLORI技术使用乙二醛和亚硝酸盐的催化体系来有效地将未甲基化的腺苷脱氨基以形成肌苷（A到I，> 98%）。肌苷在逆转录过程中与胞苷配对，然后在测序过程中被读作鸟苷（G），产生A到G的转化。但m6A保持不变，测序后仍读为A。因此，GLORI通过检测测序序列中A的比例实现了单碱基m6A的绝对定量（图7）。
图7 GLORI-seq技术原理
尽管高通量测序技术可以快速获得数千个m6A位点的数据，但由于测序过程中的偏差或技术原理上的缺陷，它们仍然会产生假阳性或假阴性结果。因此，有必要开发检测单基因m6A位点的方法。
1.2.1、MeRIP-qRT-PCR
MeRIP-qRT-PCR已被广泛用于验证通过高通量测序鉴定的m6A peaks。将mRNA或总RNA片段化为100-200nt，然后用m6A抗体进行免疫沉淀，并通过常规qRT-PCR直接定量富集到的RNA（Meyer等人，2012）（图8）。尽管MeRIP-qRT-PCR简单实用，但它不能提供单碱基分辨率，并且它依赖于m6A抗体的有效性。
图8 MeRIP-qRT-PCR技术流程
1.2.2、SELECT
基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法（SELECT）利用m6A阻碍DNA聚合酶和连接酶的事实，方便快速地检测m6A修饰及其在特定位点的程度（Xiao等人，2018）。SELECT使用DNA聚合酶和连接酶连接靶位点的两个互补DNA引物。在这个过程中，m6A首先干扰上游引物的延伸，然后阻碍下游引物的连接。尽管m6A不能以100%的效率抑制每一步，但通过两步反应可以大大减少最终产物的量。最后，目标位点的m6A修饰和甲基化程度可以通过qRT-PCR分析目标位点和对照组的循环值（Ct）之间的差异来检测（图9）。SELECT的操作简单，所有实验都可以在一个反应体系中完成，不需要额外的纯化步骤，但需要引入对照组并生成标准曲线，才能完成检测和定量分析。
图9 SELECT技术流程
1.2.3、SCARLET
位点特异性切割和放射性标记，然后连接辅助提取和TLC（SCARLET）可以在单碱基分辨率下定量检测RNA中的修饰位点，这是目前RNA修饰的“金标准”(Liu等人，2013)。RNase H用于暴露预定的m6A位点以进行放射性标记，因为RNase H消化RNA/DNA杂交体中的RNA，但不消化RNA/2-O-甲基化DNA杂交体中的RNA。使用DNA连接酶将32P标记的RNA片段夹板连接到116个核苷酸的单链DNA寡核苷酸上。然后用RNA酶T1/A处理样品以消化所有的RNA，而保留32P标记的预定m6A位点。凝胶纯化和核酸酶P1消化后，通过TLC确定m6A修饰状态（图10）。步骤复杂、实验周期长和使用放射性试剂是该方法的缺陷。
据报道，人类和小鼠细胞中大约有12000个m6A位点，主要分布在7000个mRNAs和300个ncRNAs中（Dominissini等，2012；Meyer等，2012）。m6A位点主要集中在mRNA的终止密码子、3’非翻译区（UTR）和长外显子附近，主要保守序列为RRACH（R = A/G, H = A/C/U）。
在拟南芥中，通过LC-MS/MS分析，不同生态型的m6A/A占总mRNA的比例在0.45%-0.65%之间变化。不同组织的m6A含量也存在差异，花蕾中m6A含量最高。2014年，在拟南芥中首次报道了植物m6A甲基组；Can-0中检测到7489个m6A峰，代表6289个基因的转录本；Hen-16中检测到6094个m6A峰，代表5416个基因的转录本。m6A位点在两种生态型中均占50%以上，表明m6A位点在不同生态型中保守。
随后，在不同植物中报道了多个基于MeRIP-seq的m6A测序结果，包括拟南芥、水稻、玉米、番茄、甜高粱、大麦、苹果、草莓、衣藻和毛果杨。在植物中，m6A位点主要富集在终止密码子周围和3’UTR内，表现出m6A保守基序RRACH（R = A/G, H = A/C/U），以及其他基序，如URUAY（Y = C/U）。由于MeRIP-seq的m6A分辨率约为200nt，纳米孔直接RNA-seq已被用于在拟南芥中以单碱基分辨率绘制m6A位点（Parker等，2020）。结果表明，DRAYH（D = G/U/A, R = G/A, Y = C/U, H = A/C/U）基序在m6A位点富集，其中AAACU和AAACA是检测频率最高的基序。
m6A修饰是可逆的化学修饰。它被甲基转移酶（writers）沉积，被去甲基化酶（erasers）去除，并被m6A结合蛋白（readers）识别。
图11 植物m6A的调节蛋白和分子功能
3.1、m6A WRITERS
在植物中，有两种类型的蛋白质被证明可以在mRNA中写入m6A修饰，即多蛋白写入复合体和FIONA1。多蛋白写入复合物，包括MTA（人METTL3的同源物）、MTB（人METTL14的同源物）、FIP37（人WTAP的同源物）、VIRILIZER （VIR，人VIRMA的同源物）、HAKAI和与HAKAI相互作用的锌指蛋白（HIZ2，人ZC3H13的同源物）（图11），在植物中写入了大部分m6A。这些基因的序列突变或者功能缺失会导致植物中的m6A水平降低。
3.2、m6A ERASERS
m6A去甲基化酶的发现表明m6A是一种可逆修饰，加速了对m6A功能的研究。FTO和烷基化DNA修复蛋白AlkB同源物5（ALKBH5）是哺乳动物中m6A的去甲基化酶，属于Fe (II)/a-kg依赖双加氧酶超家族。在拟南芥中，有13个ALKBH同源蛋白，其中5个（ALKBH9A/9B/9C/10A/10B）与ALKBH5同源。然而，FTO在植物中没有同源物。迄今为止，ALKBH9B和ALKBH10B的去甲基酶活性已在拟南芥中得到证实，虽然两者都能在体外去除从拟南芥中提取的RNA分子中的m6A，但只有alkbh10b突变后才能增加m6A的水平，表明ALKBH10B是一种真正的m6A去甲基化酶（Duan等，2017）。此外，一项对番茄的研究发现，SlALKBH2是一种定位于内质网的RNA m6A去甲基化酶，是番茄正常果实成熟所必需的。值得注意的是，FTO和ALKBH5都是核定位蛋白，ALKBH9B和SlALKBH2是细胞质蛋白，ALKBH10B是核-细胞质蛋白，这表明植物中可能存在不同功能的去甲基化酶（图11）。
3.3、m6A READERS
m6A修饰的功能主要取决于它的解读蛋白。迄今为止，在哺乳动物中已经鉴定出不同种类的m6A识别蛋白，包括YTH（YT521-B）结构域家族蛋白（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2）、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP）、HNRPNPA2B1、真核起始因子3（eIF3）和异质核糖核蛋白C（HNRNPC）。
有关植物中m6A readers的研究有限，主要集中在YTH结构域蛋白上。在拟南芥中，共有13种蛋白含有YTH结构域，主要来自进化保守的C-末端区（ECT）家族。拟南芥和动物的YTH结构域序列高度保守，其连续的色氨酸残基是m6A结合的关键位点。因此，拟南芥中这些含有YTH结构域的蛋白都具有结合m6A的潜力。ECT2已被证明可以在体外和体内直接结合含有m6A的RNA，且ECT2与mRNA的结合位点包含植物特异性基序URUAY和经典位点RRACH。遗传实验表明，ECT2与ECT3和ECT4是功能冗余的，表明ECT3和ECT4也是m6A readers。作为聚腺苷化因子切割和聚腺苷化特异性因子30（CPSF30）的主要亚型，CPSF30-L由CPSF30-S和一个结合m6A的YTH结构域组成，被认为是拟南芥中一种新的m6A reader。CPSF30-L是YTHDC1的同源物，位于细胞核中，参与对选择性聚腺苷酸化（APA）的调节（图11）。
4.1、RNA稳定性
调控RNA稳定性是m6A的主要功能之一，包括维持RNA稳定性和加速RNA衰变两个方面，这主要取决于不同的m6A结合蛋白。在哺乳动物中，细胞质YTHDF2通过与加工（P）体中的CCR4-NOT复合物相互作用，加速含有m6A的RNA的降解。在细胞核中，YTHDC1识别m6A标记的染色体相关调控RNA（carRNAs）的一个子集，并通过核外泌体靶向（NEXT）复合物触发它们的衰变。IGF2BP优先识别m6A修饰的GGAC基序mRNA，以增强其稳定性。目前，植物中m6A readers的研究有限，仅发现拟南芥细胞质中ECT2以依赖m6A的方式促进mRNA稳定性（Wei等，2018）。在拟南芥中，转录组学分析已被用于分析m6A对mRNA丰度的影响。在mta ABI3: MTA植物中，在缺乏m6A的情况下，m6A修饰的蛋白质编码mRNA的丰度和稳定性明显降低，因为在未修饰的m6A位点的上游直接发生4或5nt的核糖核溶解切割。在其他m6A writers组分的突变体fip37-4 LEC1:FIP37和vir1中，具有低甲基化位点的基因也倾向于下调。这些研究表明m6A参与了RNA稳定性的维持。一项对番茄的研究发现，m6A沉积通常与转录物丰度呈负相关，表明m6A在加速RNA衰变中起作用。
4.2、选择性聚腺苷酸化
选择性多腺苷酸化（APA）是一种重要的转录后调控机制。APA增加了转录组的复杂性，并影响RNA的定位、稳定性和翻译效率。在拟南芥中，最近的研究表明，m6A修饰在3’UTR加工中调节APA。在vir-1中，从3’UTR缺失m6A改变了数千个基因的poly(A)位点选择，并倾向于促进近端poly(A)位点的选择，表明m6A在poly(A)位点选择中的重要作用（Parker等，2020）。CPSF30-L的破坏也导致全局poly(A)位点转移；然而，并未表现出明显的对近端或远端poly(A)位点的偏好。进一步的分析表明，CPSF30-L识别m6A修饰的远端上游元件（FUE）以通过其m6A结合活性来控制poly(A)位点的选择。此外，VIR、FIP37或CPSF30-L的缺乏导致转录通读和mRNA嵌合体的形成，表明m6A辅助的聚腺苷酸化（m-ASP）途径在确保拟南芥转录组完整性中的重要作用。除了拟南芥，在玉米和杨树中也报道了m6A和APA之间的显著相关性。
4.3、微小RNA成熟
微小RNA（miRNAs）是一种短的非编码RNAs，在调节细胞代谢中发挥重要作用。miRNAs来源于RNA聚合酶II合成的初级miRNAs（pri-miRNAs）中存在的发夹。在mta ABI3:MTA突变体中，miRNA水平降低，但初级miRNA转录物（pri-miRNAs）积累。此外，pri-miRNAs在mta ABI3:MTA植物中低甲基化，伴随着这些转录物茎环区域二级结构减少。进一步的研究表明，由其MTA依赖性m6A甲基化状态诱导的pri-miRNAs的二级结构，以及MTA和TOUGH（TGH）之间的直接相互作用，可以影响Dicer样1（DCL1）和低分化叶1（HYL1）向植物pri-miRNAs的募集。miR393b水平的降低可能导致mta ABI3:MTA植物的生长素反应表型受损
4.4、翻译
相关研究报道m6A参与翻译调节的多种机制，包括刺激作用和抑制作用。一些研究已经探索了m6A修饰如何影响植物中的翻译，对玉米中m6A分布和多聚体占有率的分析表明，在全球范围内，m6A修饰与翻译状态呈负相关。m6A阅读器MhYTP2在苹果中的过表达增强了MhYTP2靶标和非靶标的翻译效率。另一项对苹果的研究发现，在干旱胁迫下，m6A促进了参与木质素沉积和氧化应激的基因的翻译效率。相比之下，在干旱胁迫下，纤维素和木质素相关基因的m6A比例增加，同时杨树的RNA丰度和翻译减少。
4.5、染色质调节
除了在转录后调控中的作用外，最近的研究表明m6A可以直接影响染色质状态和转录调控。在小鼠胚胎干细胞中，敲除m6A writer METTL3或核reader YTHDC1增加了染色质的可及性，并以m6A依赖的方式激活转录。此外，m6A去甲基化酶FTO的失活导致了更紧密的染色质。进一步的研究表明，METTL3在逆转录转座子上沉积m6A修饰，包括LINE1元件、内源性逆转录病毒的脑池内A颗粒（IAP）型家族和ERVK。核reader YTHDC1识别m6A标记的染色质相关RNA（caRNAs），并通过NEXT介导的核降解途径触发其衰变。METTL3还与H3K9me3甲基转移酶SETDB1及其辅因子TRIM28物理相互作用。METTL3的敲除损害异染色质标记如H3K9me3的沉积。这些结果表明，RNA m6A修饰广泛参与异染色质的维持和基因组稳定性的提高。在其他研究中，METTL3或METTL14的缺失被证明会增加全局H3K9me2水平。相反，FTO的缺失与小鼠胚胎干细胞中H3K9me2水平的降低有关。此外，作者证明m6A通过YTHDC1共转录引导KDM3B染色质靶向，导致H3K9me2的去甲基化，并最终促进基因表达。该模型表明，RNA修饰信息从RNA直接流到染色质，以建立正反馈回路，从而驱动基因表达。
一项研究还报道了RNA m6A修饰对植物染色质状态的影响。FTO在水稻中的异源表达导致mRNA和重复RNA的m6A去甲基化。进一步的研究表明，FTO诱导了转录激活和染色质的开放。此外，FTO转基因水稻显示出两种转录抑制标记H3K9me2和H3K27me3水平的显著降低（Yu等，2021）。在拟南芥中的另一项研究发现，FCA，一种RNA结合蛋白，可以与MTA、MTB和FIP37免疫共沉淀。遗传分析表明，MTA的缺乏极大地抑制了FCA的功能，导致FLC的高表达和延迟开花。m6A在COOLAIR中的存在增强了FCA和新生COOLAIR的结合能力，影响了FCA核冷凝物的形成。进一步的研究表明，在m6A修饰的调节下，FCA通过共转录RNA加工调节FLC 3’端COOLAIR R环的稳定性，从而调节染色质沉默（Xu等，2021a）。两项研究都表明，m6A在植物系统中的染色质状态调节中具有重要作用。
参考文献：
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