近年来，恶性肿瘤的发病率呈上升趋势，已成为严重危害生命健康、制约社会经济发展的一大类疾病。肿瘤的早发现和早干预对于肿瘤的预防和治疗至关重要。临床常见的肿瘤早筛方法有影像学筛查、内镜筛查及肿瘤标志物筛查等，但它们普遍存在侵入性强、敏感性低、准确性低（假阴性、假阳性）等缺点。为了弥补病理活检和循环肿瘤标志物的局限性，肿瘤早筛的液体活检应运而出。
液体活检是指通过血液、唾液、尿液等体液样本对肿瘤信号进行检测，具有无创、实时动态监测、克服肿瘤异质性等优势。目前，液体活检主要包括CTC、ctDNA、cfDNA、EVs、miRNA等，其中血浆游离DNA（cfDNA）又称为循环游离DNA，是存在于血浆中的细胞外核酸，一般呈片段化。cfDNA已逐渐成为一种很有前景的癌症生物标志物。
表观遗传学标记也可以作为疾病的指标，提示疾病风险或健康状态，DNA甲基化作为研究最为深入的表观遗传修饰之一，已广泛应用于医学及健康领域。DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展及细胞癌变有着密切的联系。目前，基于血液的DNA甲基化可以应用于癌症患者的早期诊断、预后预测、靶向治疗等方面。
Fig.1 基于血液的DNA甲基化在癌症患者中的应用（Blood-based DNA methylation signatures in cancer: A systematic review）1. DNA甲基化与肿瘤早筛
随着人类全基因组甲基化测序及图谱的广泛开展，越来越多甲基化位点被鉴别为临床表型特异性位点。多种癌症存在大量临床意义的甲基化位点可以用来指导肿瘤的检测以及预防。
在肿瘤中，全基因组及单个基因的甲基化模式往往会发生改变。通常，在肿瘤基因组中常常检测到全基因的低甲基化，但在导致肿瘤抑制基因表达沉默的特定CpG富集区域，却常常检测到高甲基化。其实，肿瘤发生的初始及进展阶段，DNA甲基化整体上就已发生了改变。有研究发现，肿瘤发生的早期就能在血浆cfDNA中检测出肿瘤相关基因的异常甲基化，且cfDNA中的异常甲基化总是与肿瘤细胞中的异常甲基化同时出现，血浆cfDNA中基因异常甲基化具有较高的敏感性和特异性。因此，游离DNA甲基化成为了一种稳定可靠的癌症标志物。
2. 基于DNA甲基化的肿瘤早筛技术
随着DNA甲基化研究的不断深入，用于肿瘤早筛的技术手段也层出不穷。医学领域中常用的检测方法大概有以下几种：
（1）液相色谱法与质谱法
液相色谱法被认为是第一代甲基化图谱的检测技术，该方法快速且定量，与质谱法相连可极大提高检测敏感性；近年发展起来的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）广泛应用于医学领域，该方法在引物设计、检测成本及数据分析等方面更加便捷、快速和准确。质谱平台灵敏度高，特异性良好，但其只能检测总的甲基化水平，无法定位具体基因的甲基化情况。
（2）芯片法
基于芯片的甲基化图谱分析是一种性价比高的甲基化检测方法，目前包括Agilent的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的Methylation EPIC v1.0（850K甲基化芯片），Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array和Affymetrix的seven-array GeneChip® Human Tiling 2.0R Array Set等。芯片法性价比高，能够达到单碱基分辨率，可在全基因组层面检测，操作简便；但是芯片法对于检测设备和检测样本有局限性，且只能覆盖有限的CpG位点，如需检测其他位点，需定制芯片，成本较高。
（3）甲基化特异性PCR(MS-PCR)法
基于亚硫酸氢盐处理，设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，以此判断被检测的位点是否发生甲基化。该方法敏感性高，适用范围广，主要用于定性研究。但是需要预先知道待测片段的DNA序列以此设计引物，还存在假阳性。
（4）荧光PCR法
利用TaqMan® 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后进行实时定量PCR。该方法敏感性高，可做多样本、多基因位点的快速分析，所需样本量少，不需要电泳分离；但其费用高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响。
（5）多重甲基化特异性PCR引物法
“多重甲基化特异性PCR引物法”结合多重PCR、亚硫酸氢盐转化和二代测序技术，针对目标基因设计多对引物，对亚硫酸氢盐转化后的DNA进行特异性扩增，再用NGS进行测序分析。该方法可实现多基因多重扩增，检测通量高；可达到单碱基分辨率，准确分析每个突变，检测精度高、准确性高；样本需求量低，广泛适用于cfDNA、FFPE等多种样本；检测周期短、费用低、性价比高，检测位点可定制化程度高，在临床应用更有优势，也是当前广受关注的新兴检测手段。
3. 爱基百客cfDNA甲基化检测技术
放眼当下，肿瘤早筛已成为了公共卫生领域的重要任务之一，该行业也迎来了前所未有的发展机遇。基于液体活检的肿瘤早筛项目是不少企业的重点布局方向，爱基百客长期致力于表观组学研究，对DNA甲基化亦有深入研究。
近期，爱基百客荣获2个相关方向的技术专利《一种多重甲基化特异性 PCR 引物设计方法及系统》和《肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物系统、检测方法及应用》。其中，《肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物系统、检测方法及应用》专利提出了一种基于肺癌血浆游离DNA进行甲基化检测所用到的多重PCR引物方法及系统，该方法设计的引物之间相互干扰小，特异性强，扩增效果好，降低了多重甲基化特异性PCR实验测试过程中的强度和难度。此外，该系统能同时检测肺癌相关的55个甲基化位点，配合高通量测序技术，可提高检测效率、降低检测成本，对肺癌高危人群具有辅助筛查和提示的作用。
随着肿瘤早筛技术的不断发展，各种肿瘤早筛相关产品也不断涌现，爱基百客自主研发的基于多重PCR的早筛技术手段也将助力于肿瘤的早发现、早干预、早治疗，为肿瘤早筛行业贡献力量。
参考文献：Heitzer E, et al. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics driven oncology. Nat Rev Genet, 2019. 20: 71-88.关于爱基百客
武汉爱基百客生物科技有限公司（简称爱基百客），位于武汉高农生物园，是一家专业提供表观组学科研服务、单细胞与空间组学测序分析和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。公司先后引入ChIP、WGBS、ATAC-seq、全转录组、10x Genomics、DNBSEQ-T7等实验平台，不断提升公司的科研服务能力。
运营期间，爱基百客也获得政府与社会高度认可，先后荣获武汉市高新技术企业认定、国家ISO9001质量管理认证、技术开发合同优秀企业认定、武汉市千企万人认定、武汉市瞪羚企业认定等多项荣誉，并获得武汉市第十二批“3551光谷人才计划”支撑和光谷人才基金的投资。
运营至今合作的科研客户超2000家，涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业，科研成果曾多次在Cancer Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL、Plant Cell等国际高水平学术期刊发表，受到了客户广泛好评，是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。
