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LUC项目文章|14-3-3蛋白BdGF14a增加了BdbZIP62的转录调控活性，从而在烟草中赋予了抗旱和抗盐能力。在近期的文章《干货！如何验证转录因子与靶基因启动子互作？》中，我们介绍了几种验证转录因子与靶基因启动子互作的方法：ChIP-qPCR、双荧光素酶报告实验（LUC）、酵母单杂交（Y1H）点对点验证和凝胶阻滞实验EMSA。通常文章会选择2种及以上技术手段进行验证，同时考虑兼顾体内验证和体外验证，在实际应用中，可以根据实验目的和样品特点选择合适的方法。今天，我们带来一篇新出炉的LUC客户文章，帮大家进一步理解“验证转录因子与靶基因启动子互作”的方法。
2024年1月15日，河南科技学院的研究团队在期刊plants（IF=4.5）发表题为“The 14-3-3 Protein BdGF14a Increases the Transcriptional Regulation Activity of BdbZIP62 to Confer Drought and Salt Resistance in Tobacco”的研究论文。在该研究中鉴定到一个二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的14-3-3基因——BdGF14a，发现它可以赋予烟草对干旱和盐碱的耐受性，并且通过酵母单杂交和LUC验证了BdGF14a能增强NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性。爱基百客为该研究提供LUC的技术支持。
一组被称为14-3-3s的调节蛋白最近被证明在对非生物胁迫的反应中发挥了重要的作用。它在种间和种内高度保守，参与植物的生长发育、光信号转导和激素调控。尽管14-3-3s在非生物胁迫功能阐释已有较多进展，但麦类模式植物“二穗短柄草”只有2个14-3-3基因在非生物胁迫响应中进行了功能研究。此外，到目前为止，关于14-3-3s在提供抗盐和干旱胁迫方面的作用的报道数量有限。
1. BdGF14a特征分析和转基因烟草生理表型分析该研究鉴定到一个来自二穗短柄草的14-3-3 基因Bradi1g11290.1，根据蛋白同源性将其命名为“BdGF14a”。qRT-PCR的结果显示BdGF14a的表达受到多种胁迫（受盐、H2O2和脱落酸(ABA)）的诱导，亚细胞定位显示其在整个洋葱细胞中均有表达。将基因BdGF14a在烟草异源表达，然后观察其表型。结果显示，BdGF14a能够提高烟草对干旱和盐碱的耐受性。
图：BdGF14a有助于转基因烟草对盐和干旱的耐受性
图：对照和BdGF14a转基因植物在干旱和盐胁迫下的生理指标 研究对胁迫相关基因进行了表达分析，发现BdGF14a可以调控胁迫相关基因的表达，增强耐盐和耐旱性，而这些基因的上调依赖于ABA。
图：BdGF14a转基因烟草在干旱和盐胁迫条件下，补充或不补充0.1毫摩尔的钨酸钠（Tu）处理五天后，参与ROS清除的基因的表达模式 此外，研究还测量了气孔的宽/长比，结果表明，BdGF14a转基因烟草提高了气孔关闭速度，减少了水分流失，提高了对盐和干旱的耐受性。
图：BdGF14a在盐和干旱处理下调节气孔运动，增加ABA敏感性 2. BdGF14a与NtABF2相互作用，调控ABA相关基因的表达为了更好地揭示BdGF14a赋予的对盐和干旱的耐受性的分子基础，研究分析了选定的ABA相关基因的转录水平。研究分析了在正常调节、干旱和盐胁迫下，NtLEA5、NtNCED1、NtABF2、NtTobLTP1、NtDRE3和NtERD10C/D基因的表达水平。根据文献，作者推测 BdGF14a能够调控NtNCED1的表达，它是ABF2潜在的靶标。因此，进行酵母双杂交和酵母单杂交检测NtABF2和BdGF14a/ABRE顺式作用元件之间的互作。正如预期，NtABF2与BdGF14a互作。
图：BdGF14a在酵母双杂交实验中与NtABF2互作，并调控ABA相关基因的表达。 3. BdbZIP62与BdGF14a相互作用，正调控对干旱和盐胁迫的响应。BdbZIP62（Bradi3g57960.1）是NtABF2的同源蛋白，是ABRE依赖的ABA信号通路的重要转录调节因子，参与植物对非生物胁迫的应答。在研究团队的一项先前研究中，发现BdbZIP62与BdGF14a发生相互作用。为了确定BdbZIP62在BdGF14a依赖的胁迫响应中的功能，首先使用qRT-PCR验证BdbZIP62在不同组织和处理的表达情况，它在所有组织均有表达，在根和叶子中表达最高。另外，它也受到胁迫诱导。综合这些发现，BdbZIP62类似于BdGF14a，对盐度和干旱敏感，这可能涉及ABA和H2O2依赖的信号通路。 同样将BdbZIP62在烟草中表达，获得稳定转化的T3代转基因烟草，研究了BdbZIP62在应对非生物胁迫中的表型。观察了表达BdbZIP62的烟草植株对干旱和盐条件的表型响应。结果表明类似于BdGF14a，在干旱和盐胁迫条件下，BdbZIP62过表达烟草的存活率分别比野生型和对照组高出15-31.2%和14.8-33.2%。研究还检测了水分流失率、植物耐受性相关生理指标。此外，BdbZIP62降低非生物胁迫下的气孔，增加转基因烟草的ABA敏感性。
图：过表达BdbZIP62的转基因烟草表现出了对干旱和盐胁迫的抗性
图：BdbZIP62在盐胁迫和干旱处理以及ABA反应下调节气孔运动。 4. BdGF14a增强了NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性前面研究结果显示NtABF2通过结合ABRE顺式调控元件与BdGF14a互作，并且在非生物胁迫下，表达BdGF14a的烟草中，ABA相关基因中NtNCED1的表达上调最高。ABRE顺式元件位于NtNCED1基因上游5’-UTR区域。研究团队进行了双荧光素酶报告基因(LUC)实验，以验证NtABF2的转录调节激活和BdGF4a对结合的影响。 NtNCED1作为靶标的94 bp启动子片段如下图A，用于LUC检测的载体构建物的草图如下图B，实验用LUC/REN比值以评估转录活性，并以共转化的pGreenII 62-SK空载体和pNtNECD1-LUC作为对照，设为1。结果表明，NtABF2可以激活pNtNECD1-LUC（下图C和D）。同时，与单独表达pGreenII 62-SK-NtABF2相比，pGreenII 62-SK-BdGF14a和pGreenII 62-SK-NtABF2与pNtNECD1-LUC共同表达，明显改善了LUC/REN比率（下图C和D）。这些观察结果表明，BdGF14a可以增加NtABF2的转录调控活性，表明NtABF2确实可以通过与其启动子中的ABRE顺式作用元件结合来激活NtNECD1的表达，而BdGF14a可以通过与NtABF2相互作用来促进NtABF2的活性。这些结果表明，BdGF14a通过与NtABF2结合并增强其转录调控活性，从而上调与ABA信号通路相关的含有ABRE顺式作用元件的基因的表达，提高了对盐胁迫和干旱的抗性。
图：BdGF14a增强了NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性 BdbZIP62是二穗短柄草种NtABF2的同源基因。因此，查明BdbZIP62是否调控转录活性以及BdGF14a能否影响这种能力。因此，使用酵母单杂交（Y1H）检测BdbZIP62对ABRE顺式作用元件的调控作用。此外，通过LUC（荧光素酶报告基因）实验进一步验证了BdbZIP62与NtNCED1启动子的相互作用，以及BdGF4a对结合的影响。结果显示BdbZIP62能激活pNtNECD1-LUC，并且相比单独表达pGreenII 62-SK-BdbZIP62，共表达pGreenII 62-SK-BdGF14a和带pNtNECD1-LUC的pGreenII 62-SK-BdbZIP62导致更高的LUC/REN比率，这表明，类似于NtABF2，共表达BdGF14a也能通过与其ABRE顺式作用元件结合，增加BdbZIP62对NtNECD1的转录调控活性。然而，在mpNtNECD1-LUC（缺乏ABRE顺式元件）对中检测到较低的LUC/REN比值。以上结果表明，BdbZIP62对NtNECD1的转录激活活性部分具有ABRE顺式元件特异性，而BdGF4a也可以通过与BdbZIP62相互作用促进转录激活活性。 该研究鉴定到一个二穗短柄草的BdGF14a基因，受到H2O2、盐和ABA的诱导；构建转基因烟草，发现其可以赋予烟草对干旱和盐碱的耐受性，表现为更高的存活率和更长的根系。然后，研究分析转基因烟草多个表型生理指标，并分析了ABA相关的基因表达情况。然后利用酵母单杂交确定了BdGF14a与NtABF2相互作用并调节与胁迫相关的基因表达。基于同源分析和前期研究，确定BdbZIP62为进一步研究对象，并构建其转基因烟草植株，分析其表型和生理指标。最后，研究利用Y1H和LUC实验，确定了BdGF14a能增强NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性，通过结合ABRE顺式元件靶向NtNECD1。因此，BdGF14a通过与BdbZIP62相互作用，增强其通过ABA介导的信号传导途径的转录调控活性，从而赋予植物对干旱和盐碱的抗性。
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