干货！破解植物和真菌ATAC-seq技术难关

ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）技术是一种利用Tn5转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术。染色质可及性，即染色质的开放程度，指的是细胞核内大分子能够与染色质中DNA发生物理接触的程度。Tn5酶倾向性地结合开放的染色质区域，ATAC-seq技术利用这种特性对开放的染色质区域进行切割，通过常规建库在捕获的片段两端加上特异性接头对该片段进行测序，从而研究染色质的可及性，以及与此相关的基因表达调控、表观遗传图谱、细胞分化、发育等问题。

ATAC-seq原理

（引用自Jason D. Buenrostro, Curr. Protoc. Mol. Biol.）

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ATAC-seq技术操作步骤简单，细胞投入量少，适用范围广，是研究染色质可及性常用的实验手段。然而，该技术受到细胞核制备质量的限制，因此，获取背景干净的完整细胞核是关键前提。相较于动物细胞，植物与真菌细胞具有细胞壁结构，部分物种的细胞壁坚韧且成分复杂，剧烈的破壁方法可能会破坏细胞核完整性，而温和的方法又无法使细胞壁破裂释放细胞核。因此，植物和真菌ATAC-seq的第一大技术难关是针对不同物种采取适应方法，破碎细胞壁和游离完整细胞核两者缺一不可。此外，植物含有叶绿体等细胞器，淀粉等次级代谢物，真菌研磨后细胞壁含有的几丁质、葡聚糖等物质形成大量沉淀，会显著增加分离干净细胞核的难度。因此，植物和真菌ATAC-seq的第二大技术难关是在破碎细胞壁后，要充分考虑如何有效去除背景杂质。

针对以上植物和真菌ATAC-seq技术提出的两大技术难关，研究人员提出了优化方法。接下来，我们来带您一起回顾一下ATAC-seq基本步骤，并展示爱基百客的部分优化成果。

（1）去除细胞壁

下面针对不同类型的植物和真菌组织提出去除细胞壁的不同方法。

第一，破碎细胞壁，直接提取细胞核。

• 方法：① 刀切；② 液氮研磨；③ 组织研磨器；④ 超声波。

• 针对新鲜幼嫩植物组织样本，如叶片、花瓣、多汁果实、幼根，建议用刀切解离组织；

• 针对木质化程度浅的植物组织样本，建议刀切预处理，镜检后视情况适当液氮研磨，速冻植物样本根据组织类型适当液氮研磨；

• 针对真菌菌丝和孢子样本，液氮研磨、组织研磨器、超声波三种方法单独或组合处理，根据物种差异使用相应方法。

爱基百客优化结果展示：

第二，消化细胞壁，制备原生质体。

• 方法：① 植物细胞壁消化酶如纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等；② 真菌细胞壁消化酶如崩溃酶、蜗牛酶等复合型酶。

爱基百客优化结果展示：

（2）裂解细胞

在初步组织解离和去除细胞壁之后，可以加入相应细胞裂解液提高细胞壁破碎程度；制备的原生质体不能直接被Tn5转座酶酶切，必须加入裂解液破除质体结构。下面介绍细胞裂解液的成分组成，根据物种差异改变相应的组分提高裂解效果。

①基本成分：Tris-HCl、蔗糖、MgCl₂等盐类

②非离子去污剂：TritonX-100、NP-40、Tween、SDS

③蛋白酶抑制剂类：PIS、PMSF

④还原剂：DTT、β-巯基乙醇

以上方法制备的植物和真菌细胞核悬液中难免会存在细胞器和次级代谢物的碎片和杂质，严重影响后续测序质量，需要进行相应去杂处理。

① 细胞筛过滤大碎片。使用不同孔径的细胞筛初步去除破碎的细胞大碎片，但叶绿体、淀粉等杂质依然存在于滤液。

② 差速离心法。低速离心沉降大杂质，取上清进行高速离心，利用杂质和细胞核的大小以及沉降速度差异初步分离细胞核。

③ 蔗糖或percoll密度梯度离心法。对于叶绿体等细胞器用以上方法难以完全去除，可以用蔗糖、percoll密度梯度离心液进行密度梯度离心。

爱基百客优化结果展示：

获得质量较高的细胞核悬液后，用细胞计数仪检测细胞核浓度，取约10万个细胞核用于转座酶切，加入Tn5酶混合液，混合液中加入适量Tween20、Digitonin成分等裂解细胞核，37℃酶切30min。

转座反应结束后用DNA提取磁珠捕获DNA片段，加入特异性接头序列进行PCR扩增，ATAC反应一般扩增9-15个循环。

用DNA纯化磁珠或DNA纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，可进行两步法片段分选去除接头、非目标小片段DNA和大片段DNA。

用Qubit检测文库浓度，Qsep400仪器（Bioptic）检测文库质量。质量较好的文库呈现三个核小体峰，大小分别是核小体的1到3倍（约170bp，340bp，500bp），核小体峰连接处圆滑呈现“碗状”。

爱基百客文库结果展示：

真菌菌丝文库库检图

植物组织文库库检图

测序返回的数据经过严格质控，过滤质量不好的数据。测序质量和结果较好的数据包含以下特征：比对相应物种的基因组，reads比对率（maprate）需大于80%；无细胞器污染；reads密度分布图在TSS附近有明显圆滑的峰，而TSS和TES之间、TES后面区域呈现下降趋势。

爱基百客数据结果展示：

真菌菌丝Reads密度分布图

植物组织Reads密度分布图

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