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组蛋白乳酸化 | CUT&Tag+RNA-seq联合解析H3K9la介导的肌肉发育调控机制南京农业大学刘红林、申明课题组在杂志《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》发表题为：Lactate promotes myogenesis via activating H3K9 lactylation-dependent up-regulation of Neu2 expression的文章，其利用Western blotting、免疫荧光、RNA-seq、CUT&Tag、ChIP等实验技术探究在C2C12细胞中乳酸盐通过促进组蛋白H3K9乳酸化介导Neu2表达上调来促进肌肉发育的调控机制。
哺乳动物的肌纤维数量在胚胎阶段就已经确定，出生后的肌肉生长只涉及肌纤维的肥大，而数量不再增长。当骨骼肌受损时，肌肉干细胞将被激活，最近的研究表明，乳酸盐可以促进体外成肌细胞分化和体内肌肉再生。然而，鲜有研究探讨乳酸盐诱导的肌肉再生发育机制。最近研究表明，乳酸盐介导的组蛋白乳酸化被确定为一种新的表观遗传修饰，促进基因转录。乳酸是否可能通过组蛋白乳酸化介导的基因表达影响成肌细胞分化机制还不清晰。
CUT&Tag、ChIP、RNA-seq、Western blotting、免疫荧光染色、细胞活力检测（CCK8）、qRT-PCR
本文的研究旨在探究乳酸对肌肉发育的促进作用，并揭示其机制。研究采用了C2C12细胞系和小鼠模型进行实验。 首先，研究人员通过Western blot和免疫荧光染色等方法，观察了乳酸处理对C2C12细胞中肌肉分化发育标志物（如MyHC）和组蛋白H3K9乳酸化水平的影响。结果显示，乳酸处理显著增加了肌肉分化发育标志物的表达，并提高了H3K9乳酸化水平。 接下来，研究人员进行了RNA测序和CUT&Tag实验，以鉴定乳酸处理对基因表达和H3K9乳酸化的影响。结果显示，乳酸处理导致了一系列基因的差异表达，并且H3K9乳酸化主要富集在基因启动子区域。进一步的功能分析表明，这些差异表达的基因与肌肉分化相关的通路有关。此外，研究人员还通过转染siRNA和小鼠模型实验证实了乳酸通过激活H3K9乳酸化依赖的Neu2表达上调来促进肌肉发育的作用。 最终构建乳酸盐调控肌再生调控机制模型；乳酸通过激活H3K9乳酸化依赖的信号通路来促进肌肉发育，这为深入理解肌肉发育调控机制提供了新的线索。
技术路线图
1.乳酸促进成肌细胞分化和组蛋白赖氨酸乳酸化 作者利用CCK-8法对成肌细胞增殖的影响进行检测，结果显示乳酸盐处理后未观察到细胞增殖速率的显著变化（图1A）。从形态学上看，乳酸盐处理后的细胞显示成肌细胞的形态更好。此外，L-乳酸/乳酸钠处理后，肌球蛋白重链（MyHC，一种成肌分化标志物）的蛋白水平和肌管形成量显著升高（图1C-E），此结果与先前的发现一致。 接下来确定L-乳酸或乳酸钠处理是否可能影响蛋白质乳酸化。使用抗Pan Kla对细胞全蛋白进行WB，发现乳酸盐显著增加了15-20 KDa左右的乳酸化蛋白水平（图1D），该区域对应为H3组蛋白的分子量。免疫荧光染色结果显示，乳酸盐诱导的乳酸化主要分布在细胞核内，进一步表明乳酸化可能发生在组蛋白上（图1 E）。
图1 乳酸升高组蛋白赖氨酸乳酸化，增强成肌细胞分化 2. 抑制乳酸盐的产生可阻碍组蛋白乳酸化和肌肉分化 单羧酸转运体（MCTs）负责将单羧酸（如乳酸）跨膜运输。作者使用MCTs（MCT1和MCT4）抑制剂AZD3965（该药物能抑制乳酸的输出并提细胞中的乳酸水平）处理细胞来进一步阐明乳酸、组蛋白乳酸化和肌球蛋白分化之间的关系。 与对照相比，AZD3965处理后肌球蛋白和组蛋白赖氨酰乳酸化水平有明显升高。接着作者使用（R）-GNE-140阻断乳酸脱氢酶（LDH）的产生。WB结果显示10μM（R）-GNE-140处理显著降低了肌球蛋白表达和组蛋白赖氨酰乳酸化水平（图2B）。（R）-GNE-140还阻断了AZD3965诱导的内源性乳酸积累、组蛋白赖氨酰乳酸化和肌球蛋白表达（图2C）。在抑制MCTs后，乳酸刺激的肌球蛋白表达和组蛋白乳酸化的上调被消除（图2D）。 此外，为了排除（R）-GNE-140的非特异性影响，作者设计了三种乳酸脱氢酶A（LDHA）的siRNA，在肌球蛋白分化期间抑制内源性乳酸的产生，并选择了siRNA＃3进行下一步实验。用siRNA＃3敲低LDHA表达显示出与LDH抑制剂类似的效果。用RNA干扰或（R）-GNE-140抑制LDH活性后，再将成肌细胞与15 mM乳酸钠一起培养4天，结果表明，补充乳酸钠不仅恢复了成肌细胞的分化活性，而且还防止了用siRNA或抑制剂处理的细胞中MyHC蛋白表达和组蛋白赖氨酸乳酸化的下降（图2E，F）。这些结果表明，乳酸诱导的组蛋白乳酸化可能有助于成肌细胞分化。
图2 改变肌细胞内乳酸水平可以调节乳酸化和细胞分化 3. 乳酸诱导的H3K9乳酸化修饰促进成肌细胞分化 为了进一步探索是哪种类型的组蛋白乳酸化参与肌肉分化，作者使用乳酸化位点特异性抗体如H3K14la、H3K9la和H3K18la进行WB检测分析。值得注意的是，L-乳酸盐和乳酸钠处理都可以以剂量依赖性方式优先增强H3K9的乳酸化水平（图3A、B），这与图1D中所示的Pan Kla的结果一致。 为了进一步证实H3K9乳酸化在成肌细胞分化中的作用，作者用C646（P300抑制剂）处理成肌细胞，WB结果显示，P300抑制剂显著降低了乳酸盐处理的成肌细胞中H3K9la和MyHC表达的水平（图3C-F）。同时，作者评估了乳酸存在下组蛋白乙酰化的水平变化，发现乳酸处理显著增加了组蛋白的乳酸化水平，而不是组蛋白的乙酰化水平（图1D），表明乳酸诱导的肌肉分化可能主要由组蛋白的乳酸化介导，乙酰化的作用可以排除。这些结果可能表明H3K9la可能参与乳酸盐诱导的成肌细胞分化。
图3乳酸处理促进H3K9la水平升高 4. H3K9la的调控靶标基因鉴定 作者检测了成肌细胞分化过程中第1~ 3天的H3K9la修饰水平。与未经乳酸处理的细胞相比，H3K9la和整体组蛋白乳酰化水平显着较高。使用 Cut&Tag 和 RNA-seq 进行了组合组学分析鉴定H3K9la的靶基因。 转录组分析显示有168个显着差异表达基因集，其中88个基因在乳酸处理组（LA）显着上调，80个基因显着下调（图4A)。接下来，作者使用MAnorm软件对富集了H3K9la抗体的注释DNA峰进行差异分析，并将结果显示为火山图（图4B)。对相应peaks进行转录起始位点（TSS）分析，发现H3K9la富集区主要分布在TSS的上下游1K左右区域（图4C)。使用chipeseeker软件来分析基因功能元素上注释峰的分布。结果显示H3K9la 主要富集在启动子区域，表明 H3K9la 在调节基因转录中可能发挥作用。接下来对启动子区域差异富集peaks关联基因进行GO和KEGG注释富集分析；结果发现一些GO和KEGG通路与肌肉分化相关过程密切相关（图4D）。 此外，使用软件对结合基序（motif）进行预测，然后将其与 Tomtom 网站（https://meme-suite.org/meme/tools/tomtom）中的已知基序数据库进行比较。有趣的是，鉴定了一个被肌源性调节因子识别的保守基序（图4E），包括肌源性分化1（MyoD）和肌细胞生成素（MyoG）。乳酸上调差异表达基因集和H3K9la主要富集peak注释到启动子区域的基因的交集，四个基因（Neu2、Syk、Nhsl2和Adgrg3）被确定为H3K9la的潜在靶标（图4F）。根据GO注释和文献报道，这四个基因中只有Neu2与肌肉分化相关；接下来作者开始探究Neu2是否参与H3K9la介导的肌分化过程。
图4 通过RNA-seq和CUT&Tag关联分析鉴定潜在靶基因 5. 在乳酸处理的肌细胞中，H3K9la在转录起始位点的结合激活Neu2转录 转录组和WB结果显示Neu2表达水平在成肌细胞分化过程中逐渐增加（图5A，B）。qRT-PCR数据显示，Neu2和MyHC的mRNA表达在乳酸（15mM）处理后3天后显著升高，与RNA-seq分析结果一致（图5C）。此外，Neu2蛋白表达在乳酸处理后明显增加（图5D）。根据CUT&Tag测序结果，利用IGV软件展示H3K9la在Neu2基因区域的结合信号，显示乳酸处理后H3K9la的富集在TSS附近的启动子区域中增加（图5E）。随后针对这一区域进行ChIP-qPCR验证，结果表明，乳酸处理明显增加了H3K9la在Neu2的TSS中的结合（图5F）。综上所述，这些结果表明，乳酸来源的H3K9la能促进成肌细胞分化过程中的Neu2转录。
图5 H3K9la激活Neu 2表达以促进成肌细胞分化 6. 抑制Neu2活性会影响乳酸诱导的成肌细胞分化 为了确定Neu2是否在乳酸介导的成肌细胞分化中起作用，作者使用了DANA（Neu2的特异性抑制剂）处理细胞。如图6A、B所示，尽管增加乳酸，DANA处理仍减少了MyHC蛋白的表达。随后设计了三对siRNA用于沉默Neu2的表达（图6C），与之前结果相一致，乳酸处理诱导的肌束数量在DANA存在的情况下也出现减少（图6D、E）。为了提高抑制效率，作者利用三种siRNA的混合物转染成肌细胞。在抑制Neu2表达后，乳酸处理上调的成肌细胞分化水平明显受到阻碍（图6F）。
图6 抑制Neu2表达可损害乳酸源性成肌细胞分化 7. 乳酸注射有助于肌肉再生和组蛋白赖氨酸乳酸化 受伤骨骼肌再生与成肌细胞分化有关。因此，作者建立的骨骼肌损伤模型（将小鼠胫骨前肌（TA）肌肉肌肉注射1.2%氯化钡来诱导肌肉损伤（图7A））来进一步验证活体内乳酸、组蛋白乳酸化和肌细胞分化之间的关系。每天对小鼠进行腹腔注射乳酸一次，持续7天（图7A）。在确定的时间点收集TA肌肉样本进行WB和H&E染色。如图7C所示，注射乳酸的小鼠肌肉中MyHC、MyoG、组蛋白乳酰化、H3K9la和Neu2的显着增高水平（图7B,C）。中心核肌纤维的减少伴随着较小纤维的减少和较大纤维的增加，所有这些都表明骨骼肌再生得到改善（图7D-F）。
图7乳酸促进肌肉再生以及组蛋白乳酸化水平升高 这项研究揭示了乳酸处理通过H3K9la激活的Neu2表达促进了成肌细胞分化和肌肉再生（图8）。这些发现不仅提高了对肌肉发育的上遗传学理解，还提供了与肌肉生长相关疾病的潜在治疗靶点。
图8乳酸源性组蛋白乳酸化促进肌肉发生的示意图模型 这项研究发现乳酸可以通过激活H3K9乳酸化来促进肌肉发育，但乳酸与其他表观遗传修饰（如甲基化、乙酰化等）之间的相互作用尚不清楚。进一步的研究可以探索乳酸与其他表观遗传修饰之间的交叉调控机制，以深入了解乳酸在基因表达调控中的作用。 这项研究发现乳酸注射可以促进受损肌肉的再生和修复。进一步的研究可以探索乳酸在肌肉损伤和疾病治疗中的潜在应用，以及乳酸与其他治疗方法（如运动、药物治疗等）的联合应用效果。 这项研究提到肌肉发育与代谢重编程密切相关。进一步的研究可以探索乳酸代谢与肌肉发育之间的调控机制，包括乳酸在能量代谢、信号传导和转录调控中的作用，以及与其他代谢物质（如葡萄糖、氧气等）之间的相互作用。
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